IT工程師數位筆記本

[摘要] 目的 探討伴有kazal域的富含半胱氨酸的逆轉誘導蛋白（RECK）與基質金屬蛋白酶9（MMP-9）在人骨肉瘤組織中的表達及相關性。 方法 選取唐山市人民醫院2001年1月～2010年12月臨床及病理資料完整存檔的人骨肉瘤組織標本34例為觀察組，另取臨床及病理資料完整存檔的骨軟骨瘤組織標本34例為對照組，采用免疫組織化學法檢測RECK和MMP-9，采用定量PCR法檢測RECK和MMP-9的mRNA，并分析指標相關性。 結果 觀察組RECK陽性率（58.8%）低于對照組（91.2%），而MMP-9陽性率（64.7%）高于對照組（11.8%），差異有統計學意義（P 0.05）。RECK陽性率、RECK的mRNA表達、MMP-9陽性率、MMP-9的mRNA表達在轉移、復發以及生存時間方面比較，差異有統計學意義（P

　　[關鍵詞] 伴有kazal域的富含半胱氨酸的逆轉誘導蛋白；基質金屬蛋白酶9；人骨肉瘤；相關性
　　[中圖分類號] R73-3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）11（c）-0016-05
　　Expression and correlation analysis of RECK and MMP-9 in human osteosarcoma tissues
　　FU Wenjuan1 DONG Guilan1 SUN Fangchu1 WANG Lianli1 GUO Jing2
　　1.The Fifth Department of Radiotherapy and Chemotherapy， People's Hospital of Tangshan City， Hebei Province， Tangshan 063000， China；2.Medical Experimental Research Center， North China University of Science and Technology， Hebei Province， Tangshan 063000，China
　　[Abstract] Objective To explore the expression and correlation analysis of RECK and MMP-9 in human osteosarcoma tissues. Methods 34 cases of human osteosarcoma tissues which had complete clinical and pathological data were selected in Tangshan People's Hospital from January 2001 to December 2010 as observation group. 34 cases of osteochondroma tissues which had complete clinical and pathological data were selected as control group. Immunohistochemical method was used to detect RECK and MMP-9. Quantitative PCR method was used to detect mRNA of RECK and MMP-9. Correlation of indexes were analyzed. Results Positive rate of RECK in observation group （58.8%） was lower than that of control group （91.2%）， positive rate of MMP-9 in observation group （64.7%） was higher than that of control group （11.8%）， with statistical difference （P 0.05）. As RECK positive rate， mRNA expression of RECK， MMP-9 positive rate， mRNA expression of MMP-9 compared in survival time， recurrence， metastasis， differences were statistically significant （P 　　[Key words] RECK； MMP-9； Human osteosarcoma； Correlation
　　人骨肉瘤是青少年兒童時期最為常見的一種惡性腫瘤[1-2]，盡管隨著醫學科技的不斷進步，切除手術與輔助化療法能夠達到一定治療效果，但腫瘤的轉移與侵襲對治愈率的影響不容忽視。據統計，患者5年內無瘤存活率僅為65%[3]。因此，對于腫瘤侵襲以及轉移機制的研究不僅能夠提高對發病機制的認識，同時有效利用阻礙腫瘤轉移屏障，對提高治療效果及預后有一定臨床意義。有研究顯示，伴有kazal域的富含半胱氨酸的逆轉誘導蛋白（RECK）具有干擾腫瘤基因表達，發揮抑制腫瘤轉移作用[4-5]。目前有關人骨肉瘤組織中RECK的表達與人骨肉瘤臨床病理特征及腫瘤轉移侵襲的報道較少。基質金屬蛋白酶9（MMP-9）基因位于染色體20q11.1～13.1，26～27kbp，具有13個外顯子和9個內含子，屬于基質金屬蛋白酶家族，其主要功能是降解和重塑細胞外基質的動態平衡。MMP-9在人骨肉瘤組織中發揮了何種作用，也是此次研究的關鍵性問題。因而開展此次研究，對人骨肉瘤組織中RECK和MMP-9進行檢查，同時對RECK、MMP-9與人骨肉瘤臨床病理表�F及轉移、侵襲的關系進行探討。具體報道如下。
　　1 資料與方法
　　1.1 一般資料
　　選擇唐山市人民醫院（以下簡稱“我院”）2001年1月～2010年12月臨床及病理資料完整存檔的人骨肉瘤組織標本34例為觀察組，入選標準：①肢體惡性人骨肉瘤；②首發患者；③接受根治性或廣泛性切除術；④接受輔助化療。所有腫瘤樣本的檢驗均由我院病理科的兩位以上副高醫師進行確診后進行。男20例，女14例，年齡5～51歲，平均（21.6±4.6）歲。本研究所有程序均經我院醫學倫理委員會審核、批準。
　　另取臨床及病理資料完整存檔的骨軟骨瘤組織標本34例為對照組，入選標準：①經病理檢查確診為骨軟骨瘤；②首發患者；③接受根治性切除術。所有腫瘤樣本的檢驗均由我院病理科的兩位以上副高醫師進行確診后進行。男21例，女13例，年齡6～53歲，平均（21.8±5.3）歲。本研究所有程序均經我院醫學倫理委員會審核、批準。
　　1.2 方法
　　1.2.1 儀器與試劑 恒溫培養箱購自北京市永光明醫療儀器有限公司；Thermo熱電FC酶標儀購自北京伯輝生物科技有限公司；iChem-340全自動生化分析儀購自深圳市庫貝爾生物科技股份有限公司；Allegra 64R臺式高速冷凍離心機購自美國貝克曼庫爾特有限公司；AM5000實時熒光定量PCR檢測系統購自上海吉泰生物科技有限公司。
　　SP染色試劑盒購自上海瑞齊生物科技有限公司；兔抗人多克隆抗體購自通派（上海）生物科技有限公司；二氨基聯苯胺/DAB染色試劑盒購自南京化學試劑有限公司；多聚賴氨酸購自美國Sigma公司。
　　1.2.2 免疫組織化學 采用標準方法制作人骨肉瘤組織石蠟切片[6]，即福爾馬林固定和石蠟包埋，具體如下：對切片進行脫蠟水化，用pH=6的枸櫞酸鈉進行修復2 min，用濃度為30 mL/L的雙氧水進行常溫封閉10 min，目的是破壞過氧化物酶的生物活性。然后用PBS緩沖液進行洗滌，重復3次，加入濃度為50 mL/L的胚胎牛血清常溫封閉20 min，控制室溫為37℃，依次用一抗、二抗孵育2 h和30 min，每次孵育后都要進行3次PBS緩沖液洗滌，用辣根過氧化酶標記生物素染色，用二氨基聯苯胺液顯色，并用蘇木精復染，而后脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察并記錄結果。判定標準要根據細胞染色強度和顯色比例進行判定，具體如下[7]：陽性細胞數目>80%計為4分，陽性細胞數目在51%～80%之間計為3分，陽性細胞數目在11%～50%之間計為2分，染色強計為3分，染色中等計為2分，染色弱計為1分。陽性細胞數目不足10%認定為陰性（-）。評分3～5分為弱陽性（+），評分6～7分為強陽性（++）。采用相同方法制作骨軟骨瘤組織標本，并行RECK檢查。同樣方法檢測MMP-9，于腫瘤侵襲邊緣和腫瘤內染色相對密集區選取4個視野，陰性（-）：無明顯陽性細胞；弱陽性（+）：陽性細胞率75%。
　　1.2.3 實時熒光定量PCR檢測
　　提取人骨肉瘤組織總RNA時，可采用Trizol試劑，將提取出來的RNA置于20 μL反應體系中，待其逆轉錄為cDNA。應用AM5000實時熒光定量PCR檢測系統進行測定，嚴格按照操作規程進行，每個樣本都要進行3次重復測量，然后取平均值。設定條件如下：在95℃下設定反應時間為5 s，在60℃下設定反應時間為30 s，實施40個循環。循環閾值要以儀器熒光預設點為限[8]。同法檢測MMP-9。
　　1.3 統計學分析
　　采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料用百分率（%）表示，采用χ2檢驗，以P
　　2 結果
　　2.1 兩組患者人骨肉瘤組織中RECK的表達情況
　　由于RECK存在于細胞質，檢測結果中組織細胞的細胞質為棕黃色，且分布模式多為彌漫性分布，少見點狀或灶狀分布。見圖1（封三）。觀察組RECK陽性結果為20例，陽性率為58.8%；對照組RECK陽性結果為31例，陽性率為91.2%。兩組患者RECK陽性率比較，差異有統計學意義（χ2=9.490，P=0.002）。
　　2.2 RECK與人骨肉瘤的臨床病理特征分析
　　RECK陽性率在年齡、性別、病發部位方面比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。RECK陽性率在轉移、復發以及生存時間方面比較，差異有統計學意義（P 　　2.3 RECK的mRNA表達與人骨肉瘤組織的臨床病理特征分析
　　RECK的mRNA表達在年齡、性別、病發部位方面比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。RECK的mRNA表達在轉移、復發以及生存時間方面比較，差異有統計學意義（P
　　2.4 兩組患者人骨肉瘤組織中MMP-9的表達情況
　　觀察組MMP-9陽性結果為22例，陽性率為64.7%；對照組MMP-9陽性結果為4例，陽性率為11.8%。兩組MMP-9陽性率比較，差異有統計學意義（χ2=20.176，P=0.000）。兩組患者人骨肉瘤組織中MMP-9的表達情況見圖2（封三）。
　　2.5 MMP-9與人骨肉瘤的臨床病理特征分析
　　MMP-9陽性率在年齡、性別、病發部位方面比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。MMP-9陽性率在轉移、復發以及生存時間方面比較，差異有統計學意義（P
　　2.6 MMP-9的mRNA表達與人骨肉瘤組織的臨床病理特征分析
　　MMP-9的mRNA表達在年齡、性別、病發部位方面比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。MMP-9的mRNA表達在轉移、復發以及生存時間方面比較，差異有統計學意義（P
　　2.7 RECK、MMP-9與人骨肉瘤組織相關性分析
　　經相關性分析，RECK與人骨肉瘤組織呈明顯負相關（r=-0.561，P=0.000）；MMP-9與人骨肉瘤組織呈明顯正相關（r=0.613，P=0.000）。
　　3 討論
　　人骨肉瘤通常發病于患者間葉組織，進而生成梭形的骨樣組織基質細胞。該類腫瘤發病迅速、惡性程度、致殘率及死亡率極高，且預后較差[9-10]。在腫瘤的發生、發展過程中基質金屬蛋白酶類家族發揮著重要作用，它不僅能夠對腫瘤組織的血管生成有一定促進作用，同時在血小板-癌細胞聚集、癌旁組織血纖維蛋白的消化、癌細胞的黏附等方面均起調控作用[11]。此外，基質金屬蛋白酶對腫瘤組織基底膜細胞具有極強的降解作用，因此調節腫瘤組織中基質金屬蛋白酶水平對于抑制腫瘤的轉移及復發是目前臨床上有關腫瘤治療的研究熱點[12]。
　　據報道，RECK定位于染色�w9P12-P13上，屬于基質金屬蛋白酶抑制劑，由971個氨基酸構成的蛋白質編碼形成，結構中羧基端的糖蛋白I和氨基端的半胱氨酸重復構造有助于促使該基因穩定結合于細胞膜之上[13-14]。目前已知，RECK廣泛存在于人體皮膚、胃腸道、血管內皮細胞等處，并參與了機體多種生理活動，包括細胞分化、細胞周期、細胞凋亡等。但RECK與人骨肉瘤的關系至今尚無明確解釋。有研究顯示，RECK可通過抑制基質金屬蛋白酶分泌發揮抑制腫瘤侵襲及轉移的作用，且該基因通常在正常組織中表達較高，在腫瘤組織中表現為弱表達甚至失表達[15]。
　　本研究采用免疫組織化學法、定量PCR法對不同臨床病理特征患者人骨肉瘤組織中RECK的表達進行研究，發現觀察組RECK陽性率（58.8%）低于對照組（91.2%），而MMP-9陽性率（64.7%）高于對照組（11. 8%）。說明34例人骨肉瘤患者組織中RECK呈降低態勢，而MMP-9有升高態勢。比較不同臨床病理特征患者人骨肉瘤患者組織中RECK的陽性細胞率發現，年齡、性別以及發病部位不同的患者人骨肉瘤患者組織中RECK的陽性細胞率差異不顯著。而對患者進行隨訪后發現，出現腫瘤轉移、腫瘤復發以及60個月內死亡的患者人骨肉瘤患者組織中RECK的陽性細胞率明顯低于未出現腫瘤轉移、腫瘤復發、生存時間≥60個月的患者，差異有統計學意義。說明RECK基因表達的下調可能伴隨著腫瘤的生長，RECK的陽性細胞率低的患者更易出現腫瘤轉移、復發。
　　定量PCR結果顯示，不同年齡、性別以及發病部位的患者，人骨肉瘤組織中mRNA的表達差異無統計學意義（P > 0.05）。但腫瘤轉移、復發以及生存時間短的患者人骨肉瘤組織中mRNA的表達較低，不同類型患者人骨肉瘤組織中mRNA的表達差異存在統計學意義（P
　　綜上所述，RECK與人骨肉瘤的關系是非常密切的。RECK因子可能為一種抑癌因子，抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移，有望成為人骨肉瘤未來診斷以及治療的潛在靶標。MMP-9也參與其中。但此次研究也存在一定弊端，樣本量較少，仍需要進一步擴大再研究。
　　[參考文獻]
　　[1] Yu H，Wu Z，Cui Y，et al. Low-grade extraskeletal osteosarcoma of the mediastinum：report of a case and review of literature [J]. Int J Clin Exp Pathol，2015，8（3）：3279-3281.
　　[2] 劉沛宜，張偉濱，王君，等.雷帕霉素對骨肉瘤干細胞和人骨肉瘤細胞中雷帕霉素靶蛋白傳導通路的抑制作用及意義[J].中華腫瘤雜志，2013，35（3）：175-180.
　　[3] Tabatabaei SH，Jahanshahi G，DehghanMarvasti F. Diagnostic challenges of low-grade central osteosarcoma of jaw：a literature review [J]. J Dent （Shiraz），2015，16（2）：62-67. 　　[4] Mahl C，Egea V，Megens RT，et al. RECK （reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motifs） regulates migration，differentiation and Wnt/β-catenin signaling in human mesenchymal stem cells [J]. Cell Mol Life Sci，2016， 73（7）：1489-1501.
　　[5] Trombetta-Lima M，Winnischofer SM，Demasi MA，et al. Isolation and characterization of novel RECK tumor suppressor gene splice variants [J]. Oncotarget，2015，6（32）：33120-33133.
　　[6] Liu W，Song N，Yao H，et al. miR-221 and miR-222 simultaneously target RECK and regulate growth and invasion of gastric cancer cells [J]. Med Sci Monit，2015，21（13）：2718-2725.
　　[7] Zhou DN，Deng YF，Li RH，et al. Concurrent alterations of RAGE，RECK，and MMP9 protein expression are relevant to Epstein-Barr virus infection，metastasis，and survival in nasopharyngeal carcinoma [J]. Int J Clin Exp Pathol，2014，7（6）：3245-3254.
　　[8] Isakoff MS，Bielack SS，Meltzer P，et al. Osteosarcoma：current treatment and a collaborative pathway to success [J]. J Clin Oncol，2015，33（27）：3029-3035.
　　[9] ALQahtani D，AlSheddi M， Al-Sadhan R. Epithelioid Osteosarcoma of the maxilla：a case report and review of the literature [J]. Int J Surg Pathol，2015，23（6）：495-499.
　　[10] Yan GN，Lv YF，Guo QN. Advances in osteosarcoma stem cell research and opportunities for novel therapeutic targets [J]. Cancer Lett，2016，370（2）：268-274.
　　[11] Rosenberg GA. Matrix metalloproteinase-mediated neuroinflammation in vascular cognitive impairment of the binswanger type [J]. Cell Mol Neurobiol，2016，36（2）：195-202.
　　[12] Lanza NL，Valenzuela F，Perez VL，et al. The matrix metalloproteinase 9 point-of-care test in dry eye [J]. Ocul Surf，2016，14（2）：189-195.
　　[13] Clark JC，Thomas DM，Choong PF，et al. RECK-a newly discovered inhibitor of metastasis with prognostic significance in multiple forms of cancer [J]. Cancer Metastasis Rev，2007，26（3-4）：675-683.
　　[14] Noda M. Roles of an extracellular matrix regulator RECK in mouse development [J]. Tanpakushitsu Kakusan Koso，2008，53（4 Suppl）：324-330.
　　[15] Li Q，Wu Y，Zhang J，et al. MicroRNA-130a regulates cell malignancy by targeting RECK in chronic myeloid leukemia [J]. Am J Transl Res，2016，8（2）：955-967.
　　[16] Zhou Z，Wang Z，Wei H，et al. Promotion of tumour proliferation，migration and invasion by miR-92b in targeting RECK in osteosarcoma [J]. Clin Sci （Lond），2016，130（11）：921-930.
　　[17] Silva M，Hernandez ME，Rojas F，et al. MicroRNA miR-182 cluster mediated modulation of RECK without changes in cell surface membrane type-1 matrix metalloproteinase （MT1-MMP） [J]. Am J Cancer Res，2015，5（9）：2918-2928.
　　[18] Trombetta-Lima M，Winnischofer SM，Demasi MA，et al. Isolation and characterization of novel RECK tumor suppressor gene splice variants [J]. Oncotarget，2015，6（32）：33120-33133.
　　[19] Hong KJ，Hsu MC，Hung WC. RECK impedes DNA repair by inhibiting the erbB/JAB1/Rad51 signaling axis and enhances chemosensitivity of breast cancer cells [J]. Am J Cancer Res，2015，5（8）：2422-2430.
　　[20] Discacciati MG，Gimenes F，Pennacchi PC，et al. MMP-9/RECK imbalance：a mechanism associated with high-grade cervical lesions and genital infection by human papillomavirus and chlamydia trachomatis [J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2015，24（10）：1539-1547.
　　（收稿日期：2016-08-06 本文�輯：王紅雙）
百度搜索“看文倉”,專業資料、生活學習,盡在看文倉,您的在線圖書館!25%；陽性（++）：陽性細胞率為25%～75%；強陽性（+++）：陽性細胞率>
歡迎轉載：http://www.kanwencang.com/xuexi/20170310/117199.html

文章列表

不含病毒。www.avast.com