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摘要：目的 對藏藥鐮形棘豆及其易混偽品進行分子鑒定，以確保該藥材的質量及臨床療效。方法 提取樣本基因組DNA，對核基因ITS2片段進行PCR擴增并測序，并對所得序列進行同源性比�^，利用MEGA軟件進行相關數據分析，并構建基于ITS2序列的鄰接（NJ）樹。結果 鐮形棘豆物種種內K2P遺傳距離為0，與其他混偽品的K2P遺傳距離分布于0.068～0.084，構建的NJ樹表明ITS2序列能夠區分鐮形棘豆與其他易混偽品。結論 ITS2序列作為DNA條形碼可以方便快捷地鑒別鐮形棘豆及其易混偽品，為其種質資源鑒定及臨床安全用藥提供了重要分子依據。

　　關鍵詞：鐮形棘豆；DNA條形碼；ITS2；分子鑒定
　　DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.019
　　中圖分類號：R282.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）02-0076-03
　　鐮形棘豆Oxytropis falcate Bunge是我國青藏高原常用的民間草藥之一，收載于1995年頒布的《衛生部藥品標準》藏藥第一冊。全草入藥，具有清熱解毒、生肌愈瘡、澀脈生血、通利大便等功效[1]。由于其突出的抗炎療效，被譽為藏醫“三大抗炎藥”之一，是奇正消痛貼膏、青鵬膏劑、流感丸、藏紅花油、棘豆扶正膠囊等多種藏藥復方或成藥的主要藥物。王棟等[2]實驗研究顯示，鐮形棘豆具有良好的外周鎮痛活性，對急性炎癥和慢性炎癥都有較好的作用。其黃酮類成分具有抗炎與抗氧化活性[3]。有研究報道，鐮形棘豆活性成分對胃癌、肝癌細胞株具有較強的細胞毒
　　但至目前為止，對藏藥鐮形棘豆生藥鑒定方面的研究還非常薄弱，并且只見于利用傳統方法進行鑒定[8]。棘豆屬近緣種植物，尤其是同生境分布的近緣種，產地來源相同、表型具有趨同性、形態特征相似，往往很難通過傳統的基原鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定等方法進行準確鑒別。因此，本研究提出采用DNA條形碼（DNA barcoding）的方法對鐮形棘豆及其易混偽品砂珍棘豆、小花棘豆、貓頭刺和甘肅棘豆等進行分子鑒定。
　　DNA條形碼技術利用短的、標準的DNA序列片段對物種進行分子鑒定[9]。因其是基于物種基因的檢測，而不是與環境密切相關的表現型，避免了人為因素和客觀條件的影響，為生藥鑒定提供了本質依據，適用于對中藥材進行真偽鑒定[10]。ITS2序列位于5.8S和28S rRNA之間，在物種水平的變異較快，已被用于多個物種的DNA條形碼鑒定[11-13]。本研究利用ITS2條形碼對鐮形棘豆及其易混偽品進行比較研究，旨在為該藥材的質量控制、臨床安全用藥及合理開發利用提供分子依據。
　　1 儀器與試藥
　　共20個樣本，來自7個物種，包括樣品及Genbank下載序列。樣品由蘭州大學生命科學學院副教授盛紅梅進行鑒定，憑證標本保存于甘肅省中醫藥研究院中藥研究所。樣品及GenBank下載序列見表1。
　　低溫高速離心機（Eppendorf，德國），恒溫水浴鍋（科哲，中國上海），PCR儀（Bio-Rad，美國），水平電泳儀（Bio-Rad，美國），凝膠成像系統（Bio-Rad，美國）。
　　植物DNA提取試劑盒、dNTP Mix、PCR buffer（10×）、Taq酶，北京天根生物技術有限公司；定量Marker DS2000，廣東東盛生物科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。
　　2 方法
　　2.1 樣品總DNA提取
　　稱取100 mg樣品組織，在預冷的研缽中進行快速充分研磨，然后利用天根植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA。經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，置4 ℃冰箱保存備用。
　　2.2 目的序列PCR擴增
　　ITS2序列擴增引物正向5'-GCGATACTTGGTGTG AAT-3'，反向5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'。反應體系25 μL，包括：DNA模板0.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP mix 0.5 μL，引物各0.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 20 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。
　　PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由上海生工生物工程有限公司完成測序。
　　2.3 數據處理與分析
　　對測序峰圖進行校對，去除引物區，使用基于HMM的注釋方法[14]，去除兩端5.8s和28s區段，獲得ITS2間隔區序列。將所有序列用Clustal X軟件進行多序列比對，利用MEGA軟件分析比對，并基于K2P模型計算序列間進化距離，用鄰接（NJ）法構建系統聚類樹。利用自展Bootstrap檢驗評價各分支的支持率，1000次重復。
　　3 結果
　　3.1 PCR產物電泳檢測
　　采用ITS2序列引物對采集樣本基因組DNA進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結。
　　3.2 種內與種間變異分析
　　20個樣本的ITS2序列平均長度為211 bp；GC含量差異較小，分布于51.2%～52.8%，平均GC含量為51.8%。K2P遺傳距離分析表明，鐮形棘豆種內的遺傳距離為0，鐮形棘豆與其易混偽品種間平均K2P距離為0.075，分布于0.068～0.084。
　　3.3 聚類分析
　　基于ITS2序列，利用軟件MEGA構建的NJ系統聚類樹顯示，不同來源的鐮形棘豆樣本聚為一支，表現出單系性，自展支持率100%。砂珍棘豆、小花棘豆、貓頭刺和甘肅棘豆也分別聚為獨立的支，與鐮形棘豆區分明顯。
　　4 討論
　　由于棘豆屬一些物種形態相似，鐮形棘豆與相同生境的同屬近緣植物難以辨識。棘豆屬其他植物如甘肅棘豆、小花棘豆等植物多具毒性[15-16]，采食有毒棘豆屬植物后常會引發動物發生中樞神經抑制、呼吸抑制，引起中毒乃至死亡，或導致動物流產、畸形[17]。偽品混用嚴重影響真品鐮形棘豆的用藥安全，因此，對鐮形棘豆藥材的準確鑒定至關重要。本研究發現，ITS2作為DNA條形碼序列，可以有效便捷地鑒別鐮形棘豆與砂珍棘豆、小花棘豆、貓頭刺和甘肅棘豆等易混偽品，具有重要的應用價值。 　　參考文獻：
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　　（收稿日期：2015-09-09）
　　（修回日期：2015-11-02；編輯：陳靜）
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