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[摘要] 目的 研究膈下逐瘀��對非酒精性脂肪肝（NAFLD）大鼠的治療作用及機制。 方法 雄性SD大鼠按完全隨機分組原則分為空白組、模型組和藥物干預組。空白組基礎飼料喂養，其余高脂飼料喂養，持續喂養12周。8周末藥物干預組開始給藥，動態觀察各組大鼠肝組織病理變化，檢測各組大鼠肝指數、血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT），肝組織TG和TC含量，以及血小板聚集率和可溶性P-選擇素（CD62p）的含量。 結果 8周末模型組HE染色的肝組織病理切片觀察到脂肪變性的肝細胞占肝小葉的比例>1/3，證明造模成功，12周末模型組大鼠各項檢測指標與空白組比較含量均有不同程度升高，差異有統計學意義（P

　　[關鍵詞] 膈下逐瘀湯；非酒精性脂肪肝；血小板；可溶性P-選擇素
　　[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）11（c）-0004-04
　　Effects of Gexia Zhuyu Decoction on lipid metabolism and platelet activation in rats with non-alcoholic fatty liver disease
　　ZHU Xiaosong FANG Tao CHEN Wenhui TAN Liping SHI Anhua
　　Basic Medical College， Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Yunnan Province， Kunming 650500， China
　　[Abstract] Objective To study the effects and mechanism of Gexia Zhuyu Decoction in rats with non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD）. Methods Male Sprague Dawley （SD） rats were randomized completely into three groups： blank group， model group and drug group. Blank group was fed with common diet， the others were fed with high-fat diet for 12 weeks. At the 8th weekend， the drug group was given Gexia Zhuyu Decoction. The pathological changes of hepatic tissue in rats of all groups were observed dynamically. The liver index， total cholesterol （TC）， triglyceride （TG）， alanine aminotransferase （ALT） in serum， TC， TG in liver specimens， and platelet aggregation， soluble P-selectin （CD62p） were measured. Results At the end of 8th weekend， the pathological section of hepatic tissue by HE staining in model group showed that， the proportion of hepatic cells with fatty degeneration accounted for hepatic lobule was over 1/3， which proved that， the model was successful. At the end of 12th weekend， all indexes of model group were higher than those in blank group， the differences were statistically significant （P
　　[Key words] Gexia Zhuyu Decoction； Non-alcoholic fatty liver disease； Platelet； Soluble P-selectin 　　非酒精性脂肪肝（NAFLD）為我國常見的慢性肝病之一，是指除酗酒原因外引起的以肝細胞內脂質過度沉積為主要病理變化的臨床綜合征[1]。現代分子病理學研究認為其發病跟胰島素抵抗、氧化應激及遺傳等因素有關[2]。目前治療仍以運動、減輕體重為主，尚無理想藥物[3]。中醫學研究認為NAFLD的基本病機是痰瘀互結，治療原則以活血化瘀、健脾祛痰為主[4]。應用活血化瘀方治療NAFLD的作用機制還未研究透徹。本研究通過喂食大鼠高脂飼料，建立早期NAFLD大鼠模型，觀察膈下逐瘀湯對NAFLD大鼠模型的作用，并從血小板活化的角度探索活血化瘀藥物膈下逐瘀湯治療NAFLD的作用機制。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 實驗動物 SPF級4周齡雄性SD大鼠120只，體重80～100 g，昆明醫科大學動物中心提供，許可證號：SCXK（滇）2011-0004。
　　1.1.2 實驗藥品 膈下逐瘀湯（處方組成：五靈脂、當歸、川芎、桃仁、丹皮、赤芍、烏藥、玄胡索、甘草、香附、紅花、枳殼，比例：9∶9∶6∶9∶6∶6∶6∶3∶9∶3∶9∶5）。制備成含生藥量1.44 g/mL的藥液[5]，4℃冰箱密封保存備用。
　　1.1.3 儀器試劑 Spectra Max 340PC酶標儀（美國分子儀器公司）；LBY-NJ血小板聚集儀（北京普利生儀器公司）。血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）檢測試劑盒（上海榮盛生物藥業有限公司）；可溶性P-選擇素（CD62p）檢測試劑盒（蘇州卡爾文生物技術有限公司）。
　　1.2 模型建立及分組給藥
　　適應性飼養3 d后編號，按完全隨機原則分為3組，空白組50只，模型組50只，藥物干預組20只。空白組喂飼基礎飼料，其余組給予自制高脂飼料（基礎飼料88%，豬油10%，膽固醇2%），自由飲水。于4、6、8周末分別處死空白組和模型組大鼠各10只，取血和肝組織樣本，動態觀察造模情況，發現8周末，脂肪變性的肝細胞占肝小葉比例>1/3，為輕度脂肪肝[6-7]，因此從8周末藥物干預組每天灌胃膈下逐瘀湯[7.2 g/（kg・d）]，空白組和模型組灌胃等體積生理鹽水，連續給藥4周，飼料不變，第10、12周分別處死各組大鼠10只。
　　1.3 �穎靜杉�
　　實驗動物禁食不禁飲12 h，10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，分離血清、血漿。取血后，處死大鼠，迅速取肝組織稱重，計算肝指數（肝指數=肝濕重/體重×100%）。取肝左葉組織10%甲醛固定，做病理組織學檢查，肝右葉制備組織勻漿檢測肝脂。
　　1.4 觀察指標
　　①肝組織病理學檢查；②全自動生化儀檢測血清TC、TG、ALT，肝組織TG和TC含量；③按照試劑盒說明書用血小板聚集儀檢測血小板聚集率；④按照試劑盒說明書采用酶標儀檢測CD62p。
　　1.5 統計學方法
　　采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，樣本符合正態分布且方差齊性時，多組間計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較時方差齊用LSD檢驗，方差不齊采用多個樣本比較的秩和檢驗（Kruskal-Wallis）法及兩兩比較的秩和檢驗（Wilcoxon）法，以P
　　2 結果
　　2.1 一般情況
　　空白組大鼠毛發整潔有光澤，行動靈活，飲食飲水正常，大便正常，體重穩定增長。模型組大鼠毛色暗淡，行動遲緩，8周后食量逐漸減少，大便黏軟，部分出現便溏現象。藥物干預組毛發趨于空白組，活動較多，大便較正常。
　　2.2 肝組織病理學變化
　　HE染色鏡下觀察（圖1，封三）：空白組大鼠肝細胞內未發現明顯脂肪空泡，肝小葉結構完整，肝索排列整齊；模型組大鼠大量肝細胞內有脂肪空泡，脂肪變性的肝細胞數目占肝小葉比例>2/3，少量肝細胞發生氣球樣變，并伴有肝細胞點狀壞死；藥物干預組可見部分肝細胞內有較小的脂肪空泡，脂變細胞數目不到肝小葉的1/3，無細胞壞死。蘇丹Ⅲ染色鏡下觀察（圖2，封三）：空白組大鼠肝細胞未見明顯紅色脂滴，模型組大鼠肝細胞內紅色脂滴廣泛分布，藥物干預組肝細胞紅色脂滴明顯減少。
　　2.3 肝指數、血脂、肝脂及血清ALT的變化
　　與空白組比較，模型組大鼠肝指數，血清TC、TG、ALT和肝組織TC、TG含量均升高，差異有統計學意義（P
　　2.4 血小板聚集率的變化
　　與空白組比較，模型組大鼠血小板聚集率第4周后升高，差異有統計學意義（P
　　2.5 血漿CD62p含量
　　與空白組比較，模型組與藥物干預組大鼠血漿CD62p含量均顯著升高，差異有高度統計學意義（P
　　3 討論
　　本研究采用改良高脂飼料復制NAFLD大鼠模型，由于造模時間較長，若使用成年大鼠在12周末實驗結束時大鼠重量太重不適合實驗，因此采用4周齡的幼鼠作為實驗對象。第8周末肝組織切片HE染色觀察到模型組大鼠肝小葉內超過1/3的肝細胞有脂肪空泡，為輕度脂肪肝，第12周末有超過2/3的肝細胞內有脂肪空泡，有的空泡融合將細胞核擠到一側，有的甚至發生氣球樣變，可見點狀壞死灶，為中重度脂肪肝，證明NAFLD模型成立[6-7]。 　　膈下逐瘀湯選自王清任《醫林改錯》，方中當歸、川芎、赤芍養血活血；桃仁、紅花、靈脂破血逐瘀；配香附、烏藥、枳殼、元胡行氣止痛，是中醫活血化瘀的經典方[8]。課題組前期研究[9-11]發現，含生藥量為1.44 g/mL的藥液藥效最為顯著，因此本研究采用了該濃度的藥液。12周末空白組大鼠肝細胞脂肪變性不明顯，幾乎看不到脂肪空泡；藥物干預組大鼠肝細胞變性較模型組輕微，變性細胞數目較少，表明膈下逐瘀湯可以減輕模型大鼠肝細胞脂肪變性的程度。由于造模所選擇的動物、方法、造模時間等因素的差異，未能找到本研究TC、TG、ALT準確的參考范圍，但跟課題組前期研究[10-11]的數據進行比較，數值還是較接近的。本研究還進行了實驗組間的比較，與空白組比較，模型組大鼠血清TC、TG和肝組織TC、TG含量均有不同程度的升高；與模型組比較，藥物干預組大鼠血清TC、TG和肝組織TC、TG含量均有不同程度降低，表明膈下逐瘀湯能夠降低NAFLD模型大鼠血脂和肝脂的水平，表明其不僅可以抑制脂質的吸收，還能促進肝臟對脂質的降解代謝。與空白組比較，模型組大鼠血清ALT含量明顯升高（P
　　傳統中醫學中沒有NAFLD的病名，根據臨床表現將其歸屬于“瘀證”“肝痞”“黃疸”等范疇，其病機為氣滯血瘀、痰瘀互結[12-13]。“血瘀”在NAFLD的發生發展中起到重要的作用[14]。通過對“血瘀證”的研究發現，其本質是血液循環障礙，血流速度變慢，血栓形成[15]。長期高脂飲食容易導致血脂升高，血液黏稠度增加，流動性降低，血小板聚集性增加，血管內皮受損，容易形成血栓，也就是出現了血瘀證的表現[16]。不難看出，血小板活化是血瘀�C發生和發展的重要病理生理基礎，為解釋血瘀證的病機提供了分子水平的客觀依據[17]。血小板活化分子表達增加，血小板的聚集性會增強，血栓形成的可能性就增加，機體就越容易出現血瘀證[18]。
　　CD62p是一種位于血小板特殊顆粒和血管內皮細胞Weibel-Palade小體內的膜糖蛋白，當血小板受刺激時快速大量地表達于血小板膜表面，介導血小板和血管內皮與炎細胞黏附以及血小板之間的黏附，進而促進纖維蛋白沉積和血栓形成，是目前發現的最能反映血小板活化程度的特異性指標之一[19-20]。血小板聚集率是中醫血瘀證量化標準之一，血小板聚集率越高越容易形成瘀血和血栓。
　　與空白組比較，從第4周造模開始，血小板聚集率就開始升高，第8周末升高更明顯（P
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　　（收稿日期：2016-08-07 本文�輯：張瑜杰）
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